遺伝子解析による未知ゲンゴロウ類の種同定
ゲノム進化ダイナミクス研究室 久保田宗一郎
昨今、地球温暖化を含めた環境問題は、大きな社会問題のひとつになっています。とりわけ、水辺に住む生き物にとっては、家庭や工業廃水等の影響によって、大きな影響を受けております。水辺を主な生息地とする今回の主役である水生昆虫もその中の一種です。水生昆虫の仲間には、ヤゴ（トンボ）のような身近な昆虫もおりますが、タガメやゲンゴロウのような大型水生昆虫は、昔はどこにでもいましたが、今では野外でほとんど見られなくなっております。残念なことに、現在、その大多数が絶滅危惧種に指定されています。このことは、水辺環境が悪化していることを物語っています。今回は、本学の卒業生で、現在理学部の非常勤講師としていくつかの科目を担当していただいている猪田利夫氏に、本研究室の訪問研究員として研究室の学生達と取り組んだ研究のうち「大型水生昆虫を研究材料にして行った研究」の一部を直接氏にまとめてもらいましたので、以下に紹介させていただきます。
ゲンゴロウの仲間は、肉食性で世界中に分布し、約4,200種以上が知られております1)。そのほとんどの種が小型から中型種（1.2～15㎜）ですが、体長が40～47㎜に達する種もいくつか知られております。その中にゲンゴロウ属（Cybister）とゲンゴロウモドキ属（Dytiscus）と呼ばれる大型ゲンゴロウ類が含まれております。前者は比較的温暖な亜熱帯地方に生息しており、後者はヨーロッパや北米などの寒い地方に生息しております2)。このように非常に多種多様なゲンゴロウ類が世界中に生息しているため、まだ未知のゲンゴロウ類が多く存在し、毎年、多数の新種が記載されております。新種を記載するための有用なひとつの手法として、遺伝子解析が欠かせません。しかしながら、ゲンゴロウ類の遺伝子を解析する上で立ちはだかった問題が一つありました。それは、ゲンゴロウ類は非常に希少な昆虫であり、国内に生息しているゲンゴロウ属とゲンゴロウモドキ属のすべてが環境省のレッドリストもしくは各自治体におけるレッドリスト掲載種であり、また種によっては法的に採集、売買、譲渡等が規制され、入手が極めて困難なことです。ゲンゴロウ類の遺伝子を研究材料とする場合には、殺した個体の筋肉からDNAを取り出し、解析に用いるのが一般的な方法でした。やはり、ゲンゴロウ類は希少種のため、できるだけ生かしたままの状態で、なおかつ少量の試料で解析することが重要と考えております。これは、生体から必要な組織を採取後、生息地にリリースすることが可能であることと、法的に入手が制限された種においては、手元にある限られたサンプルを節約したいためです。そこで、生きた個体の触覚のごく一部（先端から約数㎜）からPCR（特定の遺伝子を増幅する技術）を実施する手法を確立しました3)。この後、ゲンゴロウ類幼虫の抜け殻からも遺伝子を抽出することに成功し4)、生体に致命傷を与えないで遺伝子を解析することができるようになりました。これらの手法を確立したことで、以下に示したような希少水生昆虫を用いた遺伝子工学的な研究を効率的に進めることができるようになりました。
鳥海山山麓に生息する謎のゲンゴロウモドキ属の一種
ゲンゴロウモドキ属はユニークな上翅を持っております。メスは形態的な2型性を示しております。上翅に十数本の深い縦溝を持つメス（有溝型）と溝を持たない個体（無溝型）が存在します（図1）。同一種でありながら、しかもメスにだけあるこの特徴は、進化や交尾行動の際の異性間相互作用における研究材料に用いられております。国内に生息するゲンゴロウモドキ属はゲンゴロウモドキ（Dytiscus dauricus）、エゾゲンゴロウモドキ（Dytiscus marginalis czerskii）、シャープゲンゴロウモドキ（アズマゲンゴロウモドキ：原亜種（Dytiscus sharpi sharpi））、コゲンゴロウモドキ：別亜種（Dytiscus sharpi validus）が知られております（表1）。なお、環境省においては、シャープゲンゴロウモドキは一種として記載されておりますが、アズマゲンゴロウモドキとコゲンゴロウモドキとの間には、分布、メスの形態及びCOI遺伝子に差異があり、両亜種は進化的重要単位（evolutionarily significant units: ESU）として報告されているため5)、本稿ではそれぞれ亜種として扱いました。
図1. ゲンゴロウモドキ（D. dauricus）のメス
有溝型（左）と無溝型（右）
画像は東海大学・北野忠教授 提供
表1. 国内ゲンゴロウモドキ属の種類、分布、上翅形態
これら国産ゲンゴロウモドキ属メスは2型性（有溝型と無溝型）を持つ種が存在しております。ゲンゴロウモドキのメスは2型性（図1）、エゾゲンゴロウモドキは1型性（有溝のみ）、アズマゲンゴロウモドキは2型性、コゲンゴロウモドキは1型性（有溝のみ）を持つことが知られておりました。また、これまでに無溝型メスでエゾゲンゴロウモドキに酷似した正体不明のゲンゴロウモドキ属の一種が3個体採集されておりました6-8)。いずれも、鳥海山山麓の山形県と秋田県側で採集された個体でした。当初、私はこの正体不明なゲンゴロウモドキ属の一種は、（1）未記録の形態を持つ「エゾゲンゴロウモドキの無溝型メス」、（2）既存種である「ゲンゴロウモドキ」、そして（3）今まで記録されていない「新種」のいずれかの種ではないかと考えておりました。残念なことに、サンプル自体の入手が極めて困難なため、今までに遺伝的背景も含め、詳細な研究は行われておりませんでした。ところが、2007年に私の共同研究者の一人が山形県と秋田県の県境にある鳥海山のふもとの小さな池を調査中に、偶然、正体不明なゲンゴロウモドキ属のメスを採集しました（図2）。何年もの間、この周辺をくまなく探しましたが、この池以外では正体不明のゲンゴロウモドキ属は見つかりませんでした。この正体不明なゲンゴロウモドキ属の形態は、先に発見された3個体と全く同様な特徴を示しておりました。すなわち、外見上はエゾゲンゴロウモドキに酷似していましたが、メスに特有な上翅の明瞭な縦溝がない、いわゆる無溝型のメスでした。この貴重な個体を飼育下で繁殖することにも成功し、その子孫（サンプル番号：TI001）を用いて、この正体を探るために遺伝子解析を行いました。比較として、山形県で2005年に採集した一般的な形態である有溝型エゾゲンゴロウモドキのメス（サンプル番号：DMC3Y）も併せて解析しました。DNAを抽出し、定法に従ってPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）で目的の遺伝子（チロクローム酸化酵素サブユニット1：COI）を増幅し（769塩基対）、既に遺伝子バンクに公表されている塩基配列と比較しました。その結果、この正体不明な個体のCOI配列は既存のエゾゲンゴロウモドキのものと100％一致し、また遺伝子データを基に最尤法による分子系統樹を作成すると既存種であるエゾゲンゴロウモドキと同じ位置に分類されました（図3）。さらに、先にも記述した通り、この無溝型メスとエゾゲンゴロウモドキのオスとを交配して次世代個体を得ることもできました。よって、鳥海山山麓に生息している謎のゲンゴロウモドキ属は、エゾゲンゴロウモドキであると結論付けることができました。つまり、エゾゲンゴロウモドキは、ゲンゴロウモドキやアズマゲンゴロウモドキと同様にメスは形態的な2型性を持っていることが明らかとなりました9)。ゲンゴロウモドキ属の上翅の溝に関してRoughleyは、野外調査の結果から、生息場所によって有溝型と無溝型の比率が異なるため、上翅の形質は環境要因で決定されていることを報告しました10)。しかしながら我々は、シャープゲンゴロウモドキの2亜種の交雑実験から、上翅形質の発現は環境でなく、遺伝的に決定され、有溝型が優性の形質であること実験的に証明しました11)。従って、自然下では、劣性形質である無溝型のメスは発現しにくいのかもしれませんが、他のゲンゴロウモドキ属の種と比較して、エゾゲンゴロウモドキの無溝型メスは、分布が極端に限られ、また個体数も極めて少ない理由は未だに謎です。
図2. 鳥海山山麓で採集した謎のゲンゴロウモドキ属の無溝型メス
図3. 国産ゲンゴロウモドキ属および鳥海山山麓で採集した謎のゲンゴロウモドキ属無溝型メスの分子系統樹（最尤法）（A）とエゾゲンゴロウモドキの雌雄形態（B）
各分岐に示した数字は、1000 回の試行によるブートストラップ値（Bootstrap value：％）を、左下のスケールバーは遺伝距離を示す。*は今回解析した謎のゲンゴロウモドキ属の一種。赤字は遺伝子バンクに登録されているサンプルとそのアクセッション番号を示す。Hydaticus transversalisは外群として用いた。本図は（９）の論文から転記した。
産地不明のフチトリゲンゴロウ
東南アジアは自然が豊富で多様な生き物が生息しております。タイの市場では、食材として多くの昆虫類が取引されております。日本を含む東南アジアには形態的に類似したゲンゴロウが多数生息しています。体の色、紋様やオスの交尾器の差異によって、種同定ができる場合もありますが、老齢した個体や標本個体では変色し、またメスは交尾器では同定できないなど、種同定には厳しい要件を満たす必要があります。現在、国内では採集等が法的に禁じられている種も多くおり、厳密な種同定が要求されております。平成23年に特定国内希少野生動植物種としてゲンゴロウ属の一種であるフチトリゲンゴロウ（Cybister limbatus）が指定されました。これに指定された種は採集、売買、譲渡、飼育は原則として禁止となります。フチトリゲンゴロウは、国内では南西諸島、東南アジアに広く分布しております。しかしながら、国産種と非常に酷似した種が東南アジアにも生息しております。以前、「タイ産フチトリゲンゴロウ」という商品名でネットやペットショップなどに出回っておりました。余談ですが、タイ産フチトリゲンゴロウも国産種と同様、特定国内希少野生動植物種として法的に採集や売買等が規制されております。産地に関係なく、フチトリゲンゴロウである種は全てこの法律の規制対象となります。
ある機関から正体不明の大型ゲンゴロウの種同定の依頼がありました。依頼先からは「産地が不明なフチトリゲンゴロウと思われる個体」とのことでした。その他の情報は皆無でした。確かに外観的にはフチトリゲンゴロウにそっくりでしたが、標本であったことと保存状態がそれほど良くなかったため、本来の色彩や紋様が退色しておりました。またメスのため、交尾器から種同定することもできませんでした。従って、このゲンゴロウの素性を知るためには、遺伝子を見ること以外には考えられなかったし、依頼先からも遺伝子を調べて欲しいとのことでした。定法に従い、PCRにてCOI領域を増幅し、遺伝子バンクに登録されている国内外のゲンゴロウ属のCOI配列と比較検討を行い、このゲンゴロウの正体を暴くことを試みました。解析に用いた個体の詳細は、表2に記載しました。
また以前、私がタイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体の遺伝子を既に解析しており（未発表）、このデータも解析に加えました。国産のゲンゴロウ属全7種9個体のCOI配列（未発表）、タイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体のCOI配列（未発表）、遺伝子バンクに登録されている23種のCOI配列12, 13) 507塩基対を用いて分子系統樹を作成しました（図4）。その結果、正体不明のタイ産フチトリゲンゴロウのCOI配列は、遺伝子バンクに登録されていたゲンゴロウ属のどの種とも一致しませんでした。実験前には正体不明のタイ産フチトリゲンゴロウは、国産フチトリゲンゴロウと同一種か近縁種と予想しておりましたが、見事にこの予想が外れました。ところが、正体不明のフチトリゲンゴロウとタイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体を比較すると、COIの相同性は99.0％（707塩基/714塩基）、アミノ酸配列に置き換えると100％（236残基/236残基）と極めて高い値となりました。また、図4の系統樹から、正体不明のフチトリゲンゴロウは、国産フチトリゲンゴロウではなく、マルコガタノゲンゴロウと姉妹群を示すこともわかりました。以上のことから、正体不明のフチトリゲンゴロウは、タイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体と同一種と考えられました。同時に、タイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体もフチトリゲンゴロウではなく、形態的にフチトリゲンゴロウに酷似した未記載種であることが強く示唆されました。今回の個体を含め、これまでに我々が国産以外のフチトリゲンゴロウとして解析した個体は3個体ありましたが、これらのすべては国産フチトリゲンゴロウの遺伝子配列とは明らかに異なっておりました（未発表）。タイを含めた東南アジアには、正真正銘のタイ産フチトリゲンゴロウが存在するかもしれませんが、現時点で遺伝子バンクにその情報が登録されていないということは、まだ遺伝子が調べられていないか、あるいは、本種そのものが存在していないことを意味しております。今思えば、以前タイ産フチトリゲンゴロウという商品名で出回っていた昆虫が、本当に「タイ産フチトリゲンゴロウ」であったかは定かではありません。今後、タイ産フチトリゲンゴロウの遺伝的背景が明らかになる日が来ることを期待しておりますが、法的規制のため、東南アジアから輸入されてくるフチトリゲンゴロウは皆無となってしまった今、このまま幻のタイ産フチトリゲンゴロウとなってしまうのではないかと懸念しております。
今回紹介した2つの研究事例において、種を比較、同定する上で遺伝子解析は重要な手法であることをわかって頂けたかと思います。よく似ている種同士や詳細な情報がない種に関しては、遺伝子情報は極めて有用な基礎データとなるはずです。しかしながら、遺伝子を調べさえすれば良いわけでもありません。外観や色、サイズ（シェイプ）あるいは分布・生態・行動等も重要な情報となることは言うまでもありません。
今回紹介した2つの研究事例において、種を比較、同定する上で遺伝子解析は重要な手法であることをわかって頂けたかと思います。よく似ている種同士や詳細な情報がない種に関しては、遺伝子情報は極めて有用な基礎データとなるはずです。しかしながら、遺伝子を調べさえすれば良いわけでもありません。外観や色、サイズ（シェイプ）あるいは分布・生態・行動等も重要な情報となることは言うまでもありません。
図4. 最尤法におけるタイ産フチトリゲンゴロウを含めた国産ゲンゴロウ属全７種と外国産ゲンゴロウ属のCOI 配列の分子系統樹
各分岐に示した数字は、1000 回の試行によるブートストラップ値（Bootstrap value：％）を、左下のスケールバーは遺伝距離を示す。●は正体が不明なゲンゴロウの塩基配列、●は国産ゲンゴロウ属の塩基配列（7種、9個体）、●はタイ産フチトリゲンゴロウとして入手した個体の塩基配列を示す。外群として、C. puncticollisを用いた。種の詳細な情報は表2に示す。最近、コガタノゲンゴロウの学名はC. punctatus orientalisからC. tripunctatus lateralisに変更となった。
表2. 解析に用いた個体とその情報
* 最近、コガタノゲンゴロウの学名がC. tripunctatus orientalisからC. tripunctatus lateralisに変更された。
以上、ほんの一部ですが、猪田利夫氏がこれまでに本研究室の研究室の学生達と取り組んだ研究を紹介してもらいました。この研究は研究室構成員のにみならずに、東海大学の北野忠教授、福岡県保健環境研究所の中島淳博士並びに山形県の太田誠氏にも大変ご協力いただきましたので、ここに深く感謝いたします。また、猪田氏は今回紹介した研究も含む長年の功績が評価され、平成29年度の本学額田奨学金奨学金の授与されております。これからの研究の進展に益々目が離せません。
引用文献
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