図１　in situ ハイブリダイゼーションの原理。
　in situ ハイブリダイゼーションは目的とするRNA（mRNAとは限りません）がどこに存在しているか、つまりはどこで特定の遺伝子が転写されているかを見ることができる簡便な方法です。まず、プローブとして目的とするRNAに対して相補的なRNA（アンチセンスRNA）を人工合成します。合成反応にジゴキシゲニン-UTP（DIG-UTP）を含ませると、DIG-UTP がRNAに取り込まれてRNAがDIGで標識（ラベル）されたRNAプローブが出来上がります。これを、固定した全組織標本か薄くスライスした薄片切片に加えて一晩適切な温度と塩濃度条件でハイブリダイゼーションさせ、目的とするRNAと結合させます。翌日、非特異的に結合したプローブを洗い流した後にDIGを特異的に認識する抗体を加えて反応させます。このときにアルカリ性脱リン酸化酵素（アルカリフォスファターゼ：AP）を結合させた抗体を使用すると、ある基質を加えたときにAPがそれを分解して紫色の産物を作ります。この産物ができた場所は紫色に染まり、目的とするRNAが存在しているところなので、どこでRNAが転写されているかを見ることができます。ここでは例として、細胞性粘菌のオーガナイザー領域で転写されているSTATaのmRNA（文献３）とタンパク質には翻訳されないdutAというRNAの局在を全組織標本と薄片切片でそれぞれ観察したものを右側に示しています。また、図では示していませんが、DIGの抗体としてAPで標識されていないものを加え、さらにDIG抗体を特異的に認識する２次抗体として蛍光物質で標識した抗体を使用すると、RNAの存在場所を蛍光として観察できるようになります。このような方法はRNA FISH（fluorescence in situ hybridization）と呼ばれています。

図２　STATa遺伝子破壊株の作製と破壊株の表現型。
　上の図はSTATa遺伝子を破壊するときの模式図を示しています。原理的にはどの遺伝子を破壊するときにも同じ手法が多用されています。まず、目的とする遺伝子の全部あるいは一部をプラスミドに入れます。タンパク質を作る遺伝子であれば、その部分は含めるようにします。その遺伝子を分断するように薬剤耐性遺伝子のカセットを中央部分に入れ込みます。ここでは、ブラストサイジンSという薬剤を無害化する遺伝子（Bs^R）を用いています。このようにして作製したプラスミドをノックアウトコンストラクトと言います。これを細胞性粘菌の細胞に特殊な機械で導入すると、低い確率ではありますが、細胞が持っているSTATa遺伝子の同じ配列の部分を介して２か所で相同組み換えを起こす場合があります。その結果、元からあったSTATa遺伝子はなくなり、分断されて不活化されたSTATa遺伝子と置きかわります。このようにして出来上がった株がSTATa遺伝子破壊株で、遺伝子を破壊することをノックアウトと言います。左下の写真は野生株（野生型）の発生途中の移動体と最終的に出来上がった形の子実体を示しています。右下の写真はSTATa遺伝子破壊株の発生の様子で、短くて曲がった移動体はできますが、移動体のままでいつまでたっても子実体を作りません。そのほか、cAMPという物質に対して集合する性質（走化性）も低下し、多細胞体を作るのが５時間遅れます。このほかにももっとさまざまな欠陥がSTATa遺伝子破壊株には見られます（文献４）。細胞性粘菌の生活環については以前の記事にて紹介しましたので生物学の新知識のバックナンバーをご覧下さい。

図３　一般的な真核生物の遺伝子の構造。
　図はRNAポリメラーゼIIによって転写される真核生物の遺伝子の構造を模式化して示したものです。転写屋さんにとっては上図の全部をまとめて1つの遺伝子です。この遺伝子が最終的にタンパク質に翻訳される場合、その情報を持った配列が遺伝子の本体という感じがしますが、その上流域の配列はプロモーターといい、転写開始を調節しています。また、下流には転写の終結と転写後のRNAの安定性に関わる配列があり、ターミネーターと呼ばれます。プロモーターは基本転写因子が結合してRNAポリメラーゼIIによる転写開始を調節するコアプロモーター、組織や細胞ごとに異なる転写因子が結合する領域の近傍プロモーター、遠く離れた領域にあって転写因子によって調節されるエンハンサーやサイレンサーとして働く遠方プロモーターに分けられます。高校の生物の教科書を見ると、どうも基本転写因子が作用するコアプロモーターのことをプロモーターと呼んでいるようです。RNAポリメラーゼIやRNAポリメラーゼIIIによって転写される遺伝子はプロモーターの構造が異なります。また、RNAポリメラーゼIIによって転写される遺伝子でもタンパク質に翻訳されない遺伝子はたくさんあります。

図４　欠損させたプロモーターとレポーター遺伝子を用いた解析から調節配列を決める方法。
　左図は上流から様々な長さに欠損させたecmFプロモーターにレポーター遺伝子として大腸菌由来のlacZ遺伝子をつないだものを示しています。その時の移動体期と子実体形成期における活性の強さを、++, +, −で示しています。ecmF遺伝子の転写開始点（転写の始まる塩基の位置）は決めていないので、分かりやすいように翻訳開始点を+1と表記して、それより568塩基上流であれば−568と表記しています。−520は調節配列１(A1)と２(A2)の両方を持っていますが、−455は調節配列１のみを持っています。−366はどちらも持っていません。右の写真は−520、−455と−366それぞれの移動体期(a)と子実体形成期(b)のecmFプロモーターの活性をレポーターで検出したものです。5′Δというのは上流側から欠損させたという意味です。これを見ると、調節配列１がなくなるとecmFプロモーターの活性がなくなることがわかります。

図５　バンドシフト法によりSTATa結合の検出を試みる。
　左図はバンドシフト法の原理を示した模式図で、右の写真は実際の実験結果です。STATaなどのDNAに結合する転写因子は２本鎖DNAの特異的な配列を認識します。ecmFプロモーターの調節配列１(5′-ACAAATAATATTGT-3′という下線部分が逆方向反復配列になっているいかにも転写因子が結合しそうな配列をしています)を含む相補的な配列のDNAを2つ人工的に合成し、これを合わせて２本鎖DNAのプローブとします。このときに、5′の端をCy5という蛍光色素で標識（ラベル）しておきます。対照実験として、STATaはecmBという遺伝子のR1という抑制配列に結合することがわかっていますので（文献５）、同様に蛍光標識したecmBのプローブも合成します。実験は大腸菌で作らせて精製したSTATaとプローブを混ぜてアクリルアミドゲルで電気泳動するという単純なものです。もし、STATaがプローブの配列に結合できるのであれば、プローブの一部はSTATaとの複合体となり、STATaの分だけ分子量が重くなります。その分、電気泳動した時の移動度が遅くなります。実験では、DNAだけを検出したいので、Cy5の蛍光をイメージ化する検出器にかけると右の写真のようなイメージが得られます。これを見ると、ecmBの抑制配列には予想通り結合できますが、ecmFの調節配列１には結合していないことがわかります。

図６　STATaによるecmF プロモーターの制御モデル。
　ecmF遺伝子は移動体において将来柄をつくる予定柄細胞と言う領域（前方部分）に発現しています。予定柄細胞領域の中でもより前方部分（オーガナイザー領域）は調節配列１で、それより後方部分は調節配列２で転写が調節されていることがいろいろな解析から分かりました。図５に示すように、STATaは調節配列１には直接結合することはないので、ここには別な転写因子Xが結合すると考えられます。一方、調節配列２はSTATaには調節されず、別な転写因子Yが結合すると考えられます。さらに、転写因子XとYはそれぞれの結合がお互いの結合を安定化すると考えられ、協調的な作用があると考えられています。

図７　オーガナイザー領域で働く転写因子の階層性モデル。
　オーガナイザー領域で働く重要な転写因子であるSTATaはmybC遺伝子の発現を促進しています。STATaがmybC遺伝子プロモーターに直接結合できるかどうかは現時点ではわかりません。mybC遺伝子から転写因子MybCが作られ、MybCはecmF遺伝子の転写を活性化しています。ここでも、MybCがecmF遺伝子プロモーターに直接結合できるかどうかは現時点ではわかりません。一方で、MybCは別な転写因子であるCudAの遺伝子cudAの転写も活性化します。CudAはecmF遺伝子の転写を活性化しませんが、expL7という遺伝子の転写を活性化することが知られています。このように、オーガナイザー領域では複数の転写因子がいくつもの層状になって上下関係を持って作用し、シグナルの伝わる経路は途中で枝分かれする複雑なものであることが示されました。

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川田 健文
分子発生生物学研究室