神戸大学大学院理学研究科博士前期課程修了の濱田美里（現ダイキン工業）、分子フォトサイエンス研究センターの婦木正明助手および小堀康博教授によるグループと、東邦大学薬学部の岩田達也准教授、名古屋工業大学オプトバイオテクノロジー研究センターの神取秀樹教授、アルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルクのStefan Weber教授らによる共同研究チームは、動物の光磁気感受に重要な役割を果たすと考えられている光受容タンパク質における中間体の立体構造解析を電子スピン共鳴法によって行い、磁気コンパス特性を発現するタンパク質内部の電子的機能の詳細を明らかにしました。
　本研究成果は、渡り鳥など様々な生物が示す光と地磁気の感受性の起源と考えられている磁気コンパスにおいて、タンパク質結合水の運動性による役割を初めて示したものです。この知見から、生体分子を用いる微弱な磁気センサー開発への応用や、生物による光磁気感受に関わるシグナル伝達のしくみの理解を前進させるものとして期待がもたれます。
　本研究成果は、2021年9月30日に英国科学誌「Communications Chemistry」に掲載されました。

　渡り鳥や植物など様々な生物には、クリプトクロムとよばれる光受容タンパク質が存在します。クリプトクロムにはFADとよばれる青色光を吸収する色素が存在しており、この色素の青色光励起により近傍の複数のトリプトファン残基(W_A(H), W_B(H), W_C(H))から段階的に電子を引き抜く化学反応が進行し長距離電荷分離状態FAD^⁻･···W_C(H)^+･を生成します（図1）。この状態は、磁性を示すラジカル対として一定の寿命で存在しますが、外部磁場の方向や強度によって電子スピン状態※1が影響を受けることで、その反応収量が変化するため、渡り鳥はこのような長距離電荷分離状態の磁性による量子力学効果（磁気コンパス）を利用し地磁気の方向を感知する仮説が提唱されました[1]。しかしながら、三段階目以降にできる長距離電荷分離状態FAD^⁻･···W_C(H)^+･の前段階に生成する電荷分離状態FAD^⁻･···W_B(H)^+･は、極めて不安定で短寿命であるため、立体構造や運動性の詳細はこれまで知られておらず、磁気コンパス効果に重要な役割を果たすと考えられる電子伝達のしくみの詳細は不明でした。

　これまでの研究により小堀教授のグループは、時間分解電子スピン共鳴法※2を駆使し、植物光合成における光化学系IIや有機太陽電池など様々な系において、初期光電荷分離状態の構造解析を行ってきました[2,3]。特に、中間体スピン状態に生じる電子スピン分極※3の異方性※4を外部磁場空間方向に分解しその強度を投影する「スピン分極イメージング法」を世界に先駆けて開発し、光反応中間体の立体配置を三次元映像で可視化する方法論を確立してきました。これにより、クリプトクロムによる光反応中間体がどのような立体構造をもち、どのような電子軌道や分子運動のはたらきで電荷を伝えるのかを調べて磁気コンパス機構の全容解明につなげることが期待されていました。

　本研究では、外部磁場存在下で反応中間体の磁気的性質をマイクロ波により検出する時間分解電子スピン共鳴法を用い、光電荷分離状態を−153 ℃の低温条件と、この条件から昇温させた−33 ℃のそれぞれで観測しました。大腸菌より発現・精製したアフリカツメガエル由来のクリプトクロム（Xenopus laevis cryptochrome-DASH: XlCry-DASH）の野生型と、そのW_C(H)をフェニルアラニンに変換した変異体(W324F)の両者に対しパルスレーザー光を照射しました。これにより生成した光電荷分離によるラジカル対のマイクロ波の吸収（A）および放出（E）の信号を100ナノ秒（1千万分の1秒）の精度で検出しました（図2a）。

　このマイクロ波遷移の信号を、量子論に基づきスピン相関ラジカル対モデルにより解析しました（図2b）。そして、生成した電荷分離状態における一重項と三重項のスピン状態の量子重ねあわせと共に、W_B(H)とW_C(H)に結合する水分子（図1）の配向性に起因する一重項–三重項エネルギー差の不均一性と揺らぎを考慮した解析モデルより、電子スピン共鳴スペクトルに対する励起光偏光方向(L)の依存性を再現することに成功しました。この解析により、マイクロ波の信号（電子スピン分極）強度を外部磁場の各空間方向に投影して画像化する解析を行った結果（図2c）、互いに離れた電荷が持つスピンによる双極子間相互作用※5の主軸方向(d)を高い精度で決定しました。

　解析により、図2dのように、青色光で励起されるFAD遷移双極子モーメント(M) ※6とスピン双極子間相互作用の主軸方向(d)との関係が明らかになったことから、第二段階目の電荷分離状態FAD^⁻･···W_B(H)^+･の観測が判明しました。さらに、得られた中間体立体構造は、光照射前において知られているタンパク質構造（図1）とほとんど変化がないことが明らかになりました。これは、分子動力学法による計算機シミュレーションで予測された立体構造とは大きく異なるものでした。また、レーザー照射後の遅延時間の経過によって電子スピン共鳴スペクトルの幅（図2b）が大きく減少する結果は、観測時間の経過と共に結合水が配向変化を起こし、電荷分離状態の一重項–三重項エネルギー差の不均一性が減少していくことを示しました。これにより、結合水の再配向運動によって正電荷W_B(H)^+･が選択的に安定化を受けていることが示唆されました（図2e）。さらに、一重項–三重項エネルギー差減衰の時定数（τ= 0.34 _μs）が、W_C(H)をフェニルアラニンに変換した変異体(W324F)で得られた減衰時定数（τ= 0.16 _μs）よりも二倍程度も大きいことがわかりました。これはW324Fの疎水性アミノ酸残基であるフェニルアラニンが水素結合ネットワークから除外され、水分子への結合性が弱まったために配向緩和が高速化したことを示しています。これにより特定の結合水（図2d）による配向緩和が第二電荷分離構造の安定化に寄与していることが示されました。さらにこの水分子配向による一重項–三重項エネルギー差の解析によって、この電荷同士の軌道の重なりによる電子的相互作用※7を決定することができました。

　一方、昇温した−33 ℃においては、第三段階目の電荷分離状態FAD^⁻･···W_C(H)^+･が観測されることが時間分解電子スピン共鳴スペクトルから分かりました。この状態の立体構造のほか、一重項–三重項エネルギー差はFAD^⁻･···W_B(H)^+･に比べて小さいことが明らかになりました。解析により得られた長距離電荷分離FAD^⁻･···W_C(H)^+･の電子的相互作用は、近距離電荷分離FAD^⁻･···W_B(H)^+･での値の約10分の1程度にとどまったことから、図2dにおける結合水の熱揺らぎ運動が最終段階での電子伝達過程に重要な役割を果たすことが示唆されました（図3）。

　以上の結果と、水和高分子材料で知られているテラヘルツ分光計測の結果[4]により、特定の結合水が参加する水素結合ネットワークで起こるテラヘルツ揺らぎ（テラヘルツは、一秒間あたり1000億回の頻度を表す）が起こす熱活性化が、室温領域で起こるクリプトクロムの長距離電子伝達に役割を果たすことが示されました（図3）。これは、低温においてはこの高速揺らぎ運動の熱活性化が抑制され、低速な水分子配向緩和による近距離電荷分離FAD^⁻･···W_B(H)^+･にとどまったこと（図3）とも整合します。このようにして、水分子運動とトリプトファンどうしの軌道の重なりの連携による電子伝達の仕組みの詳細が初めて明らかになりました。

　本研究は、渡り鳥など様々な生物が示す光と地磁気の感受性の起源として有力視されている磁気コンパス効果において、タンパク質結合水の運動性による役割を初めて示したものです。今後は、中間体における結合水配位構造の詳細や、水素結合ネットワークによる揺らぎ運動の性質の詳細を明らかにする研究の進展に期待がもたれます。これらの知見から、生体分子を用いる微弱な磁気センサー開発への応用や、生物による光磁気感受に関わるシグナル伝達のしくみの理解を前進させるものとしても期待がもたれます。

　ヨーロッパコマドリが示す磁気感受性の動態観察が報告され、光誘起ラジカル対による量子力学的効果として発揮する磁気コンパス機構が多くの研究者を惹きつけてきました。ごく近年では、ヨーロッパコマドリの眼の光検出細胞に発現するクリプトクロム4（CRY4）が、磁気感受能を持たないハトやニワトリのそれと比べて中間体ラジカル生成に対する強い外部磁場効果を示すことが報告されました[5]。これによりCRY4が、渡り鳥の地磁気を検出するセンサーとして機能している可能性を示すものとして注目されています。このようなクリプトクロムが磁気センサーとして機能しているのかを明らかにする課題はまだ残っていますが、太陽光と地磁気の方向を感知する分子論的な起源の多くも不明のままとなっており、このしくみを実験的に解明することが望まれていました。

　本研究では、電子スピン分極イメージング法を駆使しクリプトクロムに生成する中間体立体構造の詳細を明らかにしただけでなく、磁気コンパス機能に極めて重要な役割を果たすと考えられる電子的相互作用を第二および第三段階目の光電荷分離状態について決定しました。これにより水分子運動による電子伝達機構を実証しました。このラジカル対では磁性を持たない一重項と磁性を示す三重項状態がある一定の寿命で存在しますが、外部磁場の方向や強度によってスピン状態が影響を受けることで、その反応収量が変化します。電子的相互作用は電荷の戻りによる失活に関わり、またこれによる一重項–三重項エネルギー差はスピン量子力学的な磁性発現の異方性に影響を与えます。これらから、水分子の運動効果による電子伝達が磁気コンパス特性を制御する新たな機構が提案されました。以上の知見は、光磁気感受に関わるシグナル伝達のしくみの理解を前進させるものであり、タンパク質を用いた微弱な磁気センサー開発への応用の展開など、今後の量子生命科学の発展に一つの契機を与えるものです。

※１　電子スピン状態
電荷の自転運動（スピン）による磁性の有無を与える状態のこと。電子対を形成しない不対電子を持つ中間体などは電子スピンの性質を示す。一つの電子スピンには、その右向きまたは左向きの自転方向に応じた ↑ と ↓の二つの量子状態が存在する。二つの電子1と2からなる二電子系では、粒子1と粒子2の対によるスピン関数は、|S＞＝(|↑₁↓₂＞－|↓₁↑₂＞)/√2や、|T₀＞＝(|↑₁↓₂＞＋|↓₁↑₂＞)/√2などで表現され、それぞれ一重項状態、三重項状態とよばれる。一重項は磁性を持たないが三重項は磁性を示す。生成した一重項ラジカル対と、三重項ラジカル対は反応性が異なる。このため量子力学的な|S＞－|T₀＞の量子重ね合わせが外部磁場の方向に依存すれば、ラジカル対の収量が外部磁場の方向によって変調を受けるため、磁気コンパス効果が期待される。

※２　電子スピン共鳴法
電子スピン状態の磁気エネルギーが、電磁石で発生させた外部磁場や中間体分子どうしの磁気エネルギーによって影響を受ける様子をマイクロ波の吸収や放出により検出する手法。時間分解電子スピン共鳴法では、ナノ秒（ナノ秒は10億分の1秒）パルスレーザーの照射直後に生成する不安定な中間体を、100ナノ秒単位の連続撮影のように観測することができる。

※３　スピン分極
電子スピン量子状態に生じた存在確率の差のこと。光電荷分離反応で生成する中間体ラジカル対では、一重項状態が選択的に生成した後、|S＞－|T₀＞間の量子重ね合わせが起これば、|T₊＞＝|↑₁↑₂＞や、|T_-＞＝|↓₁↓₂＞状態の存在確率との差を生じ、電子スピン分極が生成する。時間分解電子スピン共鳴法では、この電子スピン分極をマイクロ波の吸収や放出信号として観測する。

※４　異方性
ある性質が空間方向に対する依存性を示すこと。異方性がないことを等方性とよぶ。

※５　スピン双極子間相互作用
三重項状態を構成する二つの粒子どうしの磁気モーメントから生じる磁気的相互作用。互いの粒子が磁性を持つため異方性を示す。この異方性による応答磁場が外部磁場方向と平行になる方向を主軸という。またこの相互作用の大きさは粒子間の距離にも依存する。

※６　遷移双極子モーメント
光子が持つ振動電場が電子軌道間の遷移に応答する分子の電気双極子の方向のこと。FADなどの分子は光の偏光方向に沿って励起されるため、外部磁場に対する偏光方向効果の観測によって、生成する電荷分離状態における異方性の主軸方向を外部磁場に対して選別する観測ができる。

※７　電子的相互作用
分子どうしの電子軌道の重なりによる相互作用のこと。電子移動反応の効率はこの相互作用に依存する。また電荷分離状態では不対電子を持つ電子軌道間の重なりによって一重項–三重項エネルギー差が決まるため、電子的相互作用が一重項–三重項エネルギー差にも影響を与える。このため、この相互作用の大きさが、量子力学的な三重項スピン生成による電荷分離収量の異方性に影響を及ぼす磁気コンパス効果が予想される。

[1] Ritz, T.; Adem, S.; Schulten, K. A model for photoreceptor-based magnetoreception in birds. Biophys. J. 2000, 78, 707-718.
[2] Hasegawa, M.; Nagashima, H.; Minobe, R.; Tachikawa, T.; Mino, H.; Kobori, Y., Regulated Electron Tunneling of Photoinduced Primary Charge-Separated State in the Photosystem II Reaction Center. J. Phys. Chem. Lett. 2017, 8, 1179-1184.
[3] Kobori, Y.; Ako, T.; Oyama, S.; Tachikawa, T.; Marumoto, K. Transient Electron Spin Polarization Imaging of Heterogeneous Charge-Separation Geometries at Bulk-Heterojunction Interfaces in Organic Solar Cells. J. Phys. Chem. C 2019, 123, 13472-13481.
[4] Hoshina, H.; Kanemura, T.; Ruggiero, M. T., Exploring the Dynamics of Bound Water in Nylon Polymers with Terahertz Spectroscopy. J. Phys. Chem. B 2020, 124, 422-429.
[5] Xu, J. J.; Jarocha, L. E.; Zollitsch, T.; Konowalczyk, M.; Henbest, K. B.; Richert, S.; Golesworthy, M. J.; Schmidt, J.; Dejean, V.; Sowood, D. J. C., et al. Magnetic sensitivity of cryptochrome 4 from a migratory songbird. Nature 2021, 594, 535-+.

本研究は、科学研究費補助金「学術変革領域研究A: 動的エキシトンの学理構築と機能開拓」（20H05835、20H05831）、「基盤研究A: 電子スピン分極の三次元映像化で解く多重励起子・電荷分離立体構造の分子運動効果」(19H00888)による支援を受けて行われました。