理学部生物学科

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粘菌のオーガナイザーその2--- そこで働く転写調節因子の上下関係

前回のおさらい

 前回は形成体(オーガナイザー)と呼ばれる細胞集団が動物の初期発生、特に形作りに重要な働きをしていること、さらに細胞性粘菌と言う小さな真核生物の移動体の前部がオーガナイザーとして機能していることについて話をしました。細胞性粘菌がどのような生き物かということについて以前に解説をしましたので、こちらの生物学の新知識のバックナンバーをご覧下さい。
 さらに、細胞性粘菌のオーガナイザーで作用するSTATaという転写因子がどのようなもので、どのような働きをしているかということについても述べました。これについては、こちらの生物学の新知識のバックナンバーに詳しく書かれているのでそれをご覧下さい。

 当研究室の大学院生が細胞性粘菌のオーガナイザーで働くいろいろな遺伝子について詳しく調べて綺麗に大作の論文(文献1)としてまとめてくれました。この論文に対してDGD奨励賞というものを頂き、日本発生生物学会年会にて表彰されました。この学科のページに受賞理由が記されているのですが、おそらく中学生や高校生がこれを読んでも何のことかさっぱりわかりません。実を言うと、専門家でも「?」と言う文章です。それには理由があって、元々の受賞理由は英文で書かれていて、それを直訳したような日本語になっているので余計にわかりづらくなっています。折角の機会なので受賞した仕事についてかみ砕いてなるべくわかりやすく説明してみることにします。

序:先ずは役者を揃える

 STATaが細胞性粘菌のオーガナイザーで重要ということで、我々がまず目指したのはSTATaによって転写が促進されるような遺伝子(つまりは標的遺伝子)にどのようなものがあるかを決めることです。完全に標的であると証明されない限りは“候補”であるので、ここでは標的候補遺伝子とします。現在では次世代シークエンサーを用いた解析など多彩な方法で標的遺伝子を決めることが可能で、実際にこれら方法を用いた解析も進めています。しかし、この仕事を始めたのは20年近くも前の話です。そのような方法はまだ存在しないかほとんど用いられていませんでした。そこで、我々がとった戦法はin situハイブリダイゼーションという方法です(図1)。この方法は、目的とする遺伝子から転写されたRNAがどこにあるかを組織レベルで検出する方法です。
図1

図1 in situ ハイブリダイゼーションの原理。
 in situ ハイブリダイゼーションは目的とするRNA(mRNAとは限りません)がどこに存在しているか、つまりはどこで特定の遺伝子が転写されているかを見ることができる簡便な方法です。まず、プローブとして目的とするRNAに対して相補的なRNA(アンチセンスRNA)を人工合成します。合成反応にジゴキシゲニン-UTP(DIG-UTP)を含ませると、DIG-UTP がRNAに取り込まれてRNAがDIGで標識(ラベル)されたRNAプローブが出来上がります。これを、固定した全組織標本か薄くスライスした薄片切片に加えて一晩適切な温度と塩濃度条件でハイブリダイゼーションさせ、目的とするRNAと結合させます。翌日、非特異的に結合したプローブを洗い流した後にDIGを特異的に認識する抗体を加えて反応させます。このときにアルカリ性脱リン酸化酵素(アルカリフォスファターゼ:AP)を結合させた抗体を使用すると、ある基質を加えたときにAPがそれを分解して紫色の産物を作ります。この産物ができた場所は紫色に染まり、目的とするRNAが存在しているところなので、どこでRNAが転写されているかを見ることができます。ここでは例として、細胞性粘菌のオーガナイザー領域で転写されているSTATaのmRNA(文献3)とタンパク質には翻訳されないdutAというRNAの局在を全組織標本と薄片切片でそれぞれ観察したものを右側に示しています。また、図では示していませんが、DIGの抗体としてAPで標識されていないものを加え、さらにDIG抗体を特異的に認識する2次抗体として蛍光物質で標識した抗体を使用すると、RNAの存在場所を蛍光として観察できるようになります。このような方法はRNA FISH(fluorescence in situ hybridization)と呼ばれています。

 さて、この方法を使ってどうやってSTATaの標的候補遺伝子をピックアップするかが次の問題です。これにはSTATaタンパク質を作らない変異株(STATa遺伝子破壊株)を利用します。細胞性粘菌の場合、目的とする遺伝子があるとその機能を調べるために遺伝子の不活化を行うことが可能です。今でこそ、「ゲノム編集」という技術を用いれば多くの生物で目的の遺伝子の不活化やその他の修飾が容易く出来るようになりましたが、それまでは限られた生物でのみ「相同組み換え」の原理で遺伝子を人工的に分断して不活化することが可能でした(図2)。このようにして作製したSTATa遺伝子破壊株を利用し、野生株とSTATa遺伝子破壊株中での目的遺伝子のRNAの局在と発現の強さをin situハイブリダイゼーションで比較し、STATa遺伝子破壊株でRNAがなくなっているか量が減少しているものがないかを比較しました。
 では、どのような遺伝子を解析したのでしょうか?これについては、以前の研究で移動体の先端部分(つまりはオーガナイザーを含む領域)で特異的に発現する遺伝子が104個見つかっていたので、これらについて全部発現を比較してみました。その結果、STATa遺伝子破壊株でRNA量が減少している遺伝子が13個見つかりました(文献2)。このうちの1つが、セルロース結合能を持つ細胞外基質タンパク質を作るecmFという遺伝子です(文献3)。今回の受賞論文(文献1)は、このecmF遺伝子の転写を調節するDNA上の配列や、その配列に作用することで転写活性を制御している調節因子(転写因子)を調べることで分かった新しい事実をまとめたものです。
図2 STATa遺伝子破壊株の作製と破壊株の表現型。

図2 STATa遺伝子破壊株の作製と破壊株の表現型。
 上の図はSTATa遺伝子を破壊するときの模式図を示しています。原理的にはどの遺伝子を破壊するときにも同じ手法が多用されています。まず、目的とする遺伝子の全部あるいは一部をプラスミドに入れます。タンパク質を作る遺伝子であれば、その部分は含めるようにします。その遺伝子を分断するように薬剤耐性遺伝子のカセットを中央部分に入れ込みます。ここでは、ブラストサイジンSという薬剤を無害化する遺伝子(BsR)を用いています。このようにして作製したプラスミドをノックアウトコンストラクトと言います。これを細胞性粘菌の細胞に特殊な機械で導入すると、低い確率ではありますが、細胞が持っているSTATa遺伝子の同じ配列の部分を介して2か所で相同組み換えを起こす場合があります。その結果、元からあったSTATa遺伝子はなくなり、分断されて不活化されたSTATa遺伝子と置きかわります。このようにして出来上がった株がSTATa遺伝子破壊株で、遺伝子を破壊することをノックアウトと言います。左下の写真は野生株(野生型)の発生途中の移動体と最終的に出来上がった形の子実体を示しています。右下の写真はSTATa遺伝子破壊株の発生の様子で、短くて曲がった移動体はできますが、移動体のままでいつまでたっても子実体を作りません。そのほか、cAMPという物質に対して集合する性質(走化性)も低下し、多細胞体を作るのが5時間遅れます。このほかにももっとさまざまな欠陥がSTATa遺伝子破壊株には見られます(文献4)。細胞性粘菌の生活環については以前の記事にて紹介しましたので生物学の新知識のバックナンバーをご覧下さい。

ecmF遺伝子の転写を調節する配列を決める

 この話をする前に、遺伝子とはDNA上のどこからどこまででしょうか?これは、何を調べようとしているのか、あるいはそれを調べている研究者の専門領域によって解釈が少し違うかもしれません。以下の図3とその説明はあくまで僕のように昔から転写(特に転写因子)の研究をしてきた転写屋さんの偏った解釈かもしれませんので、その点ご了解ください。
図3 一般的な真核生物の遺伝子の構造。

図3 一般的な真核生物の遺伝子の構造。
 図はRNAポリメラーゼIIによって転写される真核生物の遺伝子の構造を模式化して示したものです。転写屋さんにとっては上図の全部をまとめて1つの遺伝子です。この遺伝子が最終的にタンパク質に翻訳される場合、その情報を持った配列が遺伝子の本体という感じがしますが、その上流域の配列はプロモーターといい、転写開始を調節しています。また、下流には転写の終結と転写後のRNAの安定性に関わる配列があり、ターミネーターと呼ばれます。プロモーターは基本転写因子が結合してRNAポリメラーゼIIによる転写開始を調節するコアプロモーター、組織や細胞ごとに異なる転写因子が結合する領域の近傍プロモーター、遠く離れた領域にあって転写因子によって調節されるエンハンサーやサイレンサーとして働く遠方プロモーターに分けられます。高校の生物の教科書を見ると、どうも基本転写因子が作用するコアプロモーターのことをプロモーターと呼んでいるようです。RNAポリメラーゼIやRNAポリメラーゼIIIによって転写される遺伝子はプロモーターの構造が異なります。また、RNAポリメラーゼIIによって転写される遺伝子でもタンパク質に翻訳されない遺伝子はたくさんあります。

 というわけで、ecmF遺伝子の転写を調節する配列を見つけるとしたらプロモーター中の配列の中にあるというのがお分かりかと思います。このための方法として昔から用いられている(そして今も用いられている)簡単な方法は、前回も少し紹介しましたがレポーター遺伝子を用いる方法です。レポーター遺伝子として大腸菌由来のlacZ遺伝子を用いて、ecmF遺伝子のプロモーターの下流に繋いであげると、プロモーターの活性をlacZ遺伝子からできるタンパク質である酵素の活性として検出でき、X-galという基質が分解されて青く染色されます。この方法を利用し、人工的にプロモーターの長さを次第に短くしていくと、あるところ以上削ると活性が極端に減少するプロモーター中の領域が少なくとも2か所見つかりました(図4)。このうち、緑の矢印で示した領域のグアニン(G)の1塩基をアデニン(A)に置換しただけで活性がなくなったので、この配列がecmFプロモーターの活性に必要であることが明らかになりました。また、緑の矢印で示した領域があってもSTATa遺伝子破壊株中では活性がなくなることから、STATaはこの配列を介してecmFの発現を調節していることが示されました。
図4 欠損させたプロモーターとレポーター遺伝子を用いた解析から調節配列を決める方法。

図4 欠損させたプロモーターとレポーター遺伝子を用いた解析から調節配列を決める方法。
 左図は上流から様々な長さに欠損させたecmFプロモーターにレポーター遺伝子として大腸菌由来のlacZ遺伝子をつないだものを示しています。その時の移動体期と子実体形成期における活性の強さを、++, +, −で示しています。ecmF遺伝子の転写開始点(転写の始まる塩基の位置)は決めていないので、分かりやすいように翻訳開始点を+1と表記して、それより568塩基上流であれば−568と表記しています。−520は調節配列1(A1)と2(A2)の両方を持っていますが、−455は調節配列1のみを持っています。−366はどちらも持っていません。右の写真は−520、−455と−366それぞれの移動体期(a)と子実体形成期(b)のecmFプロモーターの活性をレポーターで検出したものです。5′Δというのは上流側から欠損させたという意味です。これを見ると、調節配列1がなくなるとecmFプロモーターの活性がなくなることがわかります。

STATaはecmF遺伝子のプロモーターには直接に作用しない

 STATaはDNAに結合する能力を持った転写因子です。ということは、ecmFの調節配列1に結合するのかをまず調べなければいけません。このための方法もいろいろあるのですが、結合するのであれば細胞外の条件でSTATaとDNAを混ぜても結合するはずです。これを調べる最も簡単な方法がバンドシフト解析法と呼ばれるものです(図5)。この解析によって、予想に反してSTATaはecmFプロモーターの調節配列1には結合しないことがわかりました。このことは、調節配列1に結合するのは別の転写因子(仮に転写因子Xとします)で、その転写因子の発現をSTATaが調節することで間接的にSTATaがecmFの発現を調節していることを見つけました(図6)。
図5 バンドシフト法によりSTATa結合の検出を試みる。

図5 バンドシフト法によりSTATa結合の検出を試みる。
 左図はバンドシフト法の原理を示した模式図で、右の写真は実際の実験結果です。STATaなどのDNAに結合する転写因子は2本鎖DNAの特異的な配列を認識します。ecmFプロモーターの調節配列1(5′-ACAAATAATATTGT-3′という下線部分が逆方向反復配列になっているいかにも転写因子が結合しそうな配列をしています)を含む相補的な配列のDNAを2つ人工的に合成し、これを合わせて2本鎖DNAのプローブとします。このときに、5′の端をCy5という蛍光色素で標識(ラベル)しておきます。対照実験として、STATaはecmBという遺伝子のR1という抑制配列に結合することがわかっていますので(文献5)、同様に蛍光標識したecmBのプローブも合成します。実験は大腸菌で作らせて精製したSTATaとプローブを混ぜてアクリルアミドゲルで電気泳動するという単純なものです。もし、STATaがプローブの配列に結合できるのであれば、プローブの一部はSTATaとの複合体となり、STATaの分だけ分子量が重くなります。その分、電気泳動した時の移動度が遅くなります。実験では、DNAだけを検出したいので、Cy5の蛍光をイメージ化する検出器にかけると右の写真のようなイメージが得られます。これを見ると、ecmBの抑制配列には予想通り結合できますが、ecmFの調節配列1には結合していないことがわかります。

図6 STATaによるecmF プロモーターの制御モデル。

図6 STATaによるecmF プロモーターの制御モデル。
 ecmF遺伝子は移動体において将来柄をつくる予定柄細胞と言う領域(前方部分)に発現しています。予定柄細胞領域の中でもより前方部分(オーガナイザー領域)は調節配列1で、それより後方部分は調節配列2で転写が調節されていることがいろいろな解析から分かりました。図5に示すように、STATaは調節配列1には直接結合することはないので、ここには別な転写因子Xが結合すると考えられます。一方、調節配列2はSTATaには調節されず、別な転写因子Yが結合すると考えられます。さらに、転写因子XとYはそれぞれの結合がお互いの結合を安定化すると考えられ、協調的な作用があると考えられています。

STATaによって調節され、ecmFを調節する転写因子は何?

 では、転写因子Xは何か?と言うのが次の問題です。実は、CudAという転写因子がSTATaによって調節されるということがさまざまな状況証拠から示されていました(文献6)。CudAに関してはcudA遺伝子破壊株がすでに存在していましたので、この株中でのecmFの発現を調べてみました。その結果、CudAがなくてもecmFが転写されるので、少なくともecmFの活性化には関与しないことが明らかになりました。そこで、オーガナイザー領域で発現しているその他の転写因子について、STATaによって発現が促進されるけれどもCudAには促進されないという性質を目印に調べた結果、MybCという別な転写因子が候補として見つかりました(図7)。今回、MybCについて生きた細胞の中でecmFの調節配列1に結合できる転写因子Xであると証明したわけではありませんが、その可能性はあると思われます。

複数の転写因子間の階層性

 面白いことに、mybC遺伝子の破壊株も作製されていて、表現型がSTATa遺伝子破壊株やcudA遺伝子破壊株と似ていて発生が移動体のままで子実体を作れません(文献7)。このことは、これらのオーガナイザーで作用する転写因子がいずれも類似の働きがあることを示しています。さらに、mybCcudA遺伝子の発現はいずれもSTATaによって調節され、STATaよりも下層にあります。MybCの経路はecmFの発現を活性化しますが、CudAは活性化しないというようにSTATaの下層でシグナル(信号)が枝分かれし、複雑な上下関係(=階層性)があることがわかって来ました(図7)。これが今回の論文のあらましです。全然概略になっていませんが…。今後、今回見つけたことが生きた細胞の中で実際に行われているのか、他にも関わる転写因子がないか(実はあります)、STATaの本当の標的は何かなど調べるべきことがたくさんあります。
図7 オーガナイザー領域で働く転写因子の階層性モデル。

図7 オーガナイザー領域で働く転写因子の階層性モデル。
 オーガナイザー領域で働く重要な転写因子であるSTATaはmybC遺伝子の発現を促進しています。STATaがmybC遺伝子プロモーターに直接結合できるかどうかは現時点ではわかりません。mybC遺伝子から転写因子MybCが作られ、MybCはecmF遺伝子の転写を活性化しています。ここでも、MybCがecmF遺伝子プロモーターに直接結合できるかどうかは現時点ではわかりません。一方で、MybCは別な転写因子であるCudAの遺伝子cudAの転写も活性化します。CudAはecmF遺伝子の転写を活性化しませんが、expL7という遺伝子の転写を活性化することが知られています。このように、オーガナイザー領域では複数の転写因子がいくつもの層状になって上下関係を持って作用し、シグナルの伝わる経路は途中で枝分かれする複雑なものであることが示されました。

文献

  1. Saga, Y., Inamura, T., Shimada, N. & Kawata, T. (2016) Regulation of ecmF gene expression and genetic hierarchy among STATa, CudA, and MybC on several prestalk A-specific gene expressions in Dictyostelium. Develop. Growth & Differ. 58:383-399.
  2. Shimada, N., Maeda, M., Urushihara, H. and Kawata, T. (2004a) Identification of new modes of Dd-STATa regulation of gene expression in Dictyostelium by in situ hybridisation. Int. J. Dev. Biol. 48:679-682.
  3. Shimada, N., Nishio, K., Maeda, M., Urushihara, H. and Kawata, T. (2004b) Extracellular matrix family proteins that are potential targets of Dd-STATa in Dictyostelium discoideum. J. Plant. Res. 117:345-353.
  4. Kawata, T. (2011) STAT signaling in Dictyostelium development. Develop. Growth & Differ. 53:548-557.
  5. Kawata, T., Shevchenko, A., Fukuzawa, M., Jermyn, K. A., Totty, N. F., Zhukovskaya, N. V., Sterling, A. E., Mann, M. & Williams, J. G. (1997) SH2 signaling in a lower eukaryote: A STAT protein that regulates stalk cell differentiation in Dictyostelium. Cell 89:909-916.
  6. Fukuzawa, M. & Williams, J. G. (2000) Analysis of the promoter of the cudA gene reveals novel mechanisms of Dictyostelium cell type differentiation. Development 127:2705-2713.
  7. Guo, K., Anjard, C., Harwood, A., Kim, H.-J., Newell, P. C. & Gross, J. D. (1999) A myb-related protein required for culmination in Dictyostelium. Development 126:2813-2822.

川田 健文
分子発生生物学研究室

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